1、選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。
2、塗片不宜太過厚，以免脫色不完全造成假陽性。
3、脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。
1、選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。
2、塗片不宜太過厚，以免脫色不完全造成假陽性。
3、脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。
注意事項
１、選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。
２、塗片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。
３、脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。
實驗流程
１、取載玻片用紗布擦乾，載玻片的一面用馬克筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。塗菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
２、塗片
液體培養基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近５釐米左右開啟管蓋；右手持接種環在火焰中燒灼滅菌，等冷卻後從試管中沾取菌液一環，在潔淨無脂的載玻片上塗直徑２毫米左右的塗膜，最後將接種環在火焰上燒灼滅菌。
固體培養基：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環取少量菌體，塗在載玻片上，使其薄而均勻。
３、晾乾：讓塗片在空氣中自然乾燥。
４、固定：讓菌膜朝上，透過火焰２－３次固定（以不燙手為宜）。
５、染色：將固定過的塗片放報紙上，滴加草酸銨結晶紫液，染１分鐘。
６、水洗：用水緩慢沖洗塗片上的染色液，用吸水紙吸乾。簡單染色結束可觀察細胞形態。
７、媒染：滴加１滴碘液，染１分鐘，水洗。
８、脫色：吸去殘留水，連續滴加９５％乙醇脫色２０－３０秒至流出液無紫色，立即水洗。
９、復染：滴加蕃紅復染３－５分鐘，水洗。至此，革蘭氏染色結束。
酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。
革蘭氏染色法，是指細菌學中廣泛使用的一種重要的鑑別染色法，屬於復染法。這種染色法是由丹麥醫生革蘭於1884年所發明，最初是用來鑑別肺炎球菌與克雷伯肺炎菌。革蘭染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。未經染色的細菌，由於其與周圍環境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難區別。經染色後，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特徵，從而用以分類鑑定。染色原理：透過結晶紫初染和碘液媒染後，在細菌細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，再用95%乙醇脫色。