如何構建一個基因的過表達載體

　　1、首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。

　　2、用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。

　　3、將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，首先鹼基互補配對結合，兩個黏性末端吻合在一起，鹼基之間形成氫鍵。

　　4、再加入適量DNA連線酶，催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連線起來，形成一個重組DNA分子。如人的胰島素基因就是透過這種方法與大腸桿菌中的質粒DNA分子結合，形成重組DNA分子。

　　1、切割質粒和目的基因的限制酶必須是同-.種酶，以獲得相同的黏性末端，利於重組質粒的構建。插入的目的基因只是結構基因部分，其表達需要調控序列，因而用作載體的質粒的插入部位前須有啟動子，後須有終止子。

　　2、透過載體把目的基因片段匯入活細胞。構建基因表達載體也就是把目的基因和載體連線，使目的基因在受體細胞中穩定存在，並且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。

　　基因表達載體的構建，即目的基因與運載體結合，是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心，其構建目的是使目的基因能在受體細胞中穩定存在，並且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。

　　構建條件：

　　1、必須能夠在宿主細胞中複製，使重組基因能夠在宿主基因中複製，從而穩定儲存下來，這是作為運載體的必須條件。

　　2、具有多個限制酶切點，從而可以使不同的粘性末端與之相連，增強實用性。

　　3、擁有標記基因，方便質粒進入宿主細胞後容易被檢測出來，以便檢測目的基因是否匯入受體。