引物是怎麼合成的

　　引物合成的具體實驗步驟：

　　1、脫掉附加在CPG擔體上的第一個鹼基5羥基基團上的保護基，準備附加下一個新的鹼基；

　　2、活化新的鹼基單體，準備與第一個鹼基進行反應；

　　3、第二個鹼基與第一個鹼基發生偶聯反應；

　　4、將沒有反應的第一個鹼基的5羥基加帽封死，使其不再進一步參與反應；

　　5、將核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯。

　　6、重複進行第一步到第五步的迴圈，直至合成完所需的Oligo DNA序列。

　　7、合成結束後，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進行進一步的純化。

　　在合成引物時，公司通常要求標註合成引物的濃度，通常用OD值表示，如1OD、2OD、5OD等。

　　OD值即光密度值，DNA採用紫外吸光譜法定量，一個OD值的定義為在260奈米波長下，1毫升體積水溶液，1釐米光程，吸光度為1安。合成引物時，為了確定引物濃度，可以在260奈米波長下測量吸光度，然後使用光吸收值和微摩消光係數的倒數，透過Beers法則計算出引物濃度。通常1個OD值的合成引物DNA的質量約為33微克。

　　1、將預先連線在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5羥基的保護基團DMT，獲得遊離的5羥基。

　　2、合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3端被活化，5羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5羥基發生縮合反應。

　　3、帶帽反應，縮合反應中可能有極少數5羥基沒有參加反應，用乙酸酐和甲基咪唑終止其後繼續發生反應，這種短片段可以在後續環節根據實驗需要來選擇純化方式分離掉。

　　4、在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。這樣即可合成引物。